Il luogo dove sorgono le catacombe di San Sebastiano era anticamente una profonda depressione, utilizzata come cava di pozzolana e chiamata ad catacumbas (ovvero letteralmente "presso le cavità"), nome che è diventato sinonimo di cimitero sotterraneo. Fin dal I secolo il sito è stato intensamente sfruttato e costruito: le gallerie sotterranee sono state riutilizzate per ricavare loculi, mentre in superficie sono stati realizzati diversi colombari e almeno due sistemi abitativi (le cosiddette Villa grande e Villa piccola) dotati di notevoli decorazioni parietali pittoriche. Intorno alla metà del II secolo, il fondo della valle fu interrato per creare una piazzola, su un lato della quale furono costruiti in successione tre mausolei (di Marcus Clodius Ermete, degli Innocentiores, dell'Ascia). Un ulteriore interramento dell'area è stato fatto per dare spazio alla costruzione della cosiddetta "Triclia", luogo coperto da una tettoia con invocazioni agli apostoli Pietro e Paolo, che venivano venerati insieme in questo luogo intorno al 250. Sul sito l'imperatore Costantino (306-337) fece costruire successicamente una basilica a forma di circo romano (chiamata "circiforme"). Nel frattempo, già nel III secolo, iniziò a svilupparsi nel sottosuolo la catacomba che ospitava le tombe dei martiri Sebastiano ed Eutichio.